Prof. Layton kembali beraksi dalam sebuah kasus. Kali ini ia akan berhadapan dengan musuh yang lebih kuat dalam memecahkan teka-teki desa misterius. Kali ini pertualangan akan berpusat pada pencarian kebenaran melalui sebuah kotak yang ditemui oleh Luke dan dibuka olehnya. Layton harus memecahkan misteri tersebut sebelum semuanya terlambat. Prof. Layton bersama dengan muridnya Luke, harus berjuang memecahkan berbagai puzzle yang tak terhitung jumlahnya untuk mengungkap pembunuh mentor dari Prof. Layton. Memecahkan misteri kotak tersebut, perjalanan panjang pun harus ditempuh.