Dikendalikan oleh sekelompok Tiki jahat, para hewan di Donkey Kong Island, para penghuni Donkey Kong Island telah mencuri semua Banana Hoard dari Donkey Kong dan mencuri semua simpanan pisang yang ia punya. Tentu saja ia menginginkan semuanya kembali lagi ke dirinya.
Retro Studios kembali membawa Donkey Kong ke sebuah permainan dengan gaya side-scrolling adventure, lengkap dengan karakter yang tentunya sudah tidak asing lagi serta level-level yang menakjubkan yang pastinya akan menarik hasrat dari para gamer yang menginginkan sebuah game Donkey Kong versi Super NES. Untuk pertama kalinya pula, franchise ini memberikan sebuah kemampuan bagi dua orang gamer untuk bermain bersama-sama pada saat yang bersamaan. Satu orang sebagai Donkey Kong dan satu lagi sebagai Diddy Kong. Gamer juga bisa menjelajahi permainan tersebut secara terpisah ataupun bersama-sama. Diddy Kong bisa bertengger di belakang Donkey Kong dan pergi kapanpun ia mau, sehingga memungkinkan para gamer yang masih awam bisa bertengger di punggung Donkey Kong melintasi area yang jauh lebih menantang dari game tersebut.